พระมหากษัตริย์แห่งอยุธยา ลำดับที่ 16 ทรงเป็นพระราชโอรสพระองค์ที่สองในสมเด็จพระมหาจักรพรรดิกับพระสุริโยทัย พระองค์ทรงขึ้นครองราชย์ในขณะที่ฝ่ายหงสาวดีกำลังทำสงครามกับกรุงเศรีอยุธยาในปี พ.ศ. 2111
สมเด็จพระมหินทราธิราชได้แต่งตั้งให้พระยารามเป็นผู้บัญชาการรบป้องกันพระนคร พระยารามเป็นขุนพลเจนศึก สามารถจัดกำลังป้องกันพระนครได้เข้มแข็ง ฝ่ายหงสาวดีเห็นว่าถ้าฝ่ายอยุธยายังมีขุนพลนี้ก็จะทำให้พิชิตอยุธยาได้ยาก จึงวางกลอุบายหลอกให้สมเด็จพระมหินทราธิราชส่งพระยารามมาให้แก่ฝ่ายหงสาวดีแล้วจะยอมสงบศึก ซึ่งฝ่ายอยุธยาก็ยอมทำตาม และได้ให้พระสังฆราชฝ่ายกรุงศรีอยุธยาทูลเชิญสมเด็จพระมหินทราธิราชเสด็จออกมาถวายบังคมแก่พระองค์ แล้วพระองค์ก็จะยอมสงบศึกได้ ฝ่ายสมเด็จพระมหินทราธิราชทรงมีพระเกียรติยศมิยอมอ่อนข้อให้แก่ฝ่ายหงสาวดีจึงไม่เสด็จออกไปถวายบังคมพระเจ้าบุเรงนอง
หลังจากฝ่ายอยุธยาเสียพระยารามแล้วฝ่ายหงสาวดีก็ยังไม่สามารถยึดกรุงศรีอยุธยาได้ เนื่องจากสมเด็จพระมหินทราธิราชได้ทรงบัญชาการรบด้วยพระองค์เอง
ต่อมาสมเด็จพระมหาธรรมราชาจึงเสนอกลอุบายให้แก่พระเจ้าบุเรงนองว่าให้ส่งออกญาจักรีไปเป็นไส้ศึกในเมือง เห็นจะพิชิตอยุธยาได้ พระเจ้าบุเรงนองเห็นชอบก็แสร้งทำเป็นให้ออกญาจักรีหนีกลับไปอยุธยาได้ โดยพระเจ้าบุเรงนองได้ทรงประหารทหารหงสาวดีแล้วเสียบประจานไว้หน้าค่ายเพื่อให้สมเด็จพระมหินทราธิราชสิ้นสงสัยในการมาของออกญาจักรี
เมื่อออกญาจักรีกลับถึงกรุงศรีอยุธยา สมเด็จพระมหินทราธิราชทรงไว้วางพระทัยในตัวออกญาจักรีเนื่องจากเป็นขุนศึกเก่าที่ช่วยสมเด็จพระมหาจักรพรรดิป้องกันพระนครเมื่อศึกครั้งก่อน จึงได้พระราชทานตำแหน่งให้เป็นผู้บัญชาการกองกำลังทั้งหมดในการปกป้องพระนคร
ฝ่ายออกญาจักรีเห็นเป็นจังหวะเหมาะจึงได้สับเปลี่ยนโยกย้ายกำลังพลตามอำเภอใจทำให้ การป้องกันพระนครอ่อนกำลังลง และเป็นเหตุให้ฝ่ายหงสาวดีสามารถเข้ายึดกรุงศรีอยุธยาได้ในที่สุด
หลังจากฝ่ายหงสาวดียึดเมืองได้แล้ว พระเจ้าบุเรงนองได้ทูลเชิญสมเด็จพระมหินทราธิราชเสด็จไปประทับยังกรุงหงสาวดี และแต่งตั้งให้สมเด็จพระมหาธรรมราชาขึ้นปกครองกรุงศรีอยุธยาต่อในฐานะประเทศราช เมื่อสมเด็จพระมหินทราธิราชเสด็จมาถึงเมืองแครงก็ทรงประชวรและเสด็จสวรรคตที่เมืองนั้น